Pembalap Italia harus melalui kualifikasi pertama dengan keras setelah hari Jumat yang sulit. Namun, setelah berhasil menyesuaikan konfigurasi Ducati Desmosedici GP25, ia mampu mencatatkan rekor baru di sirkuit dengan waktu 1:52,303. Di kualifikasi kedua, Bagnaia memulai putarannya di paruh kedua, tanpa gangguan dari pembalap lain yang sedang jeda. Hal ini membuatnya mematahkan dominasi Marc Marquez dan menempatkan rider Spanyol tersebut di posisi kedua setelah ia terjatuh di Tikungan 13.
Meskipun demikian, Marc Marquez akan memulai balapan dari posisi kedua dan dijagokan sebagai favorit utama untuk meraih kemenangan saat balapan MotoGP Republik Ceko. Di barisan terdepan, Fabio Quartararo akan membawa bendera Yamaha dan menempati posisi paling belakang, sementara barisan kedua akan dibuka oleh Marco Bezzecchi yang crash sebelum Tikungan 1. Di posisi kelima ada Joan Mir yang mencatatkan hasil terbaik di hari Sabtu, diikuti oleh Raul Fernandez yang akan start di urutan keenam setelah pencapaian terbaiknya di kualifikasi.
Peluang Pedro Acosta untuk podium diprediksi setelah ia berhasil menduduki posisi ketujuh di grid, sedangkan Alex Marquez menempati posisi kedelapan. Sementara itu, Johann Zarco dan Jack Miller melengkapi sepuluh besar. Jorge Martin akan memulai balapan comeback-nya dari urutan kedua belas setelah mencatatkan waktu 1,3 detik dari posisi terdepan. Pecco Bagnaia berhasil lolos dari Q1 dengan waktu 1:52,715, sementara Pol Espargaro dan Alex Rins harus absen dari balapan setelah kualifikasi. Brad Binder, pemenang terakhir di sirkuit ini, berada di posisi kesembilan belas di grid, diikuti oleh Ai Ogura dan wild card, Augusto Fernandez.
